-
Confocal Microskop odnosi se na svoj poseban optički mikroskop koji može snimiti optičke kriške.
Svjetljenjem i posmatranjem jedinstvene difrakcijske granične točke, optička reza se realizuje u laserskom konfokalnom sistemu. To zahtijeva da se dva segmenta snopa imaju isti fokus, tako da su "CONFOCAL". Suprotno slikama širokog polja, konfokalne slike nemaju nesposobnost zamućenja. To je samo po sebi prednost, jer je duboka slika uzorka jasna i bogata detaljima. Međutim, najvažnija prednost je njegov trodimenzionalni vizualizacijski potencijal sa mikroskopskim karakteristikama. Nakon što se niz slika stekne duž z-stog, 3D objekt je rekonstruiran i prikazan od strane računara.
- Kopoželno osvjetljenje
Iskušavanje izvora svjetla pokazuje se fokusiranjem izvora svjetla na malom otvoru (pinhole), a zatim je fokusirajući na uzorku. Kad je otvor otvor blevar, točka osvjetljenja ograničena je samo difrakcijom, a ne geometrijskim parametrima izvora svjetlosti i otvora. Obični izvor svjetlosti je veliki površinski izvor površine, tako da je nemoguće usmjeriti na difrakcijsku granicu. Stoga, iako je odašiljač vrlo niska, ovakvo je fokusirano svjetlo za osvjetljenje vrlo potrebno (za tradicionalne izvore svjetlosti).
Slika 1: Osvetljenje za konfokalno snimanje. Svjetlost iz izvora svjetla (LS) fokusirana je na osvjetljenje za osvjetljenje (PI), a zatim ulazi u uzorak s ..
Laser kao izvor svjetlosti ima vrlo visoku kolimaciju (svjetlost u dobrom laseru je "izuzetno paralelna"). Stoga se laser može fokusirati na difrakcijsko ograničeno mjesto kroz jednu sočivu bez korištenja rupe. Zbog toga većina konfokalnih mikroskopa nema osvjetljenju. Kvaliteta svjetlosnog mjesta ovisi o kvaliteti snopa lasera. Ako kvaliteta nije dobra, možete umetnuti i vezanje osvjetljenja. Laser je obično spojen na konfokalni mikroskop kroz optičke vlakne. Ova vlakna sama djeluju kao i prstenovi.
Fokulizacija i visoka gustina energije lasera čine ga idealnim izvorom svjetla za konfokalni mikroskop. Koherencija lasera nije potrebna karakteristika konfokalnih performansi. Naprotiv, to je izazov za optičke dizajnere, jer će uzrokovati lažne uzorke smetnji, pa su potrebne pažljive strategije dizajna.
Pored toga, činjenica da tradicionalni laser emitira samo jednu boju (lasersko-"liniju") ima svoja ograničenja. U multi-fluorescenciji za snimanje i mjerenje potrebno je složeni multi-laserski aranžman. Bijeli laser vješto rješava problem višebojnih slika.
Slika 2: Usporedba konfokalne (desne oblasti) i ne-konfokalno snimanje. U mišem za vitražom od felulgena. Mnogo informacija o nekonfokalnim slikama ne dolazi iz žarišta. Kopovetna optika eliminira sve nejasne faktore i čini strukturu čistom.
Confocal Detection
Većina detektora ima prilično veliko osjetljivo područje (fotomultiplijske cijevi su obično nekoliko kvadratnih centimetara). Potrebno je konfokalno optiku. Stoga je potrebno izvesti otkrivanje spota umetanjem malog otvora (pinhole) u svjetlosnom snopu. Usredsređivanjem svjetla uzorka na prikupljanje, prikupljanje i snimanje prenesenog svjetla.
Budući da difrakcijski obrazac ovisi o numeričkom otvoru i talasnoj dužini, neophodna je prepoznavanje pilinga. Stoga, kada se ovi parametri promijene, veličina pilinga mora se podesiti.
Kada se objektivni objektiv mijenja (obično s promjenom numeričkog otvora), moderni mikroskop sa konfokalnim skeniranjem automatski će promijeniti promjer za miješanje. Stoga su prstenovi obično dizajnirani kao dvostruki ili višeslojni otvori.
Zapravo, odgovarajuća veličina pipele ne ovisi ne samo na talasnoj dužini i numeričkom otvoru, već i na unutrašnjem uvećanju optičkih elemenata u mikroskopu.
Stoga, nije samo nepoželjna, već i krivo direktno usporediti promjere rupe u mikroskopima s različitim dizajnom. Ako promjer pilinga nije postavljen na optimalnu vrijednost, sustav neće moći da izvrši optički rezanje (to jest prenošenje zamućenja odstupanja) ili nepotrebno odsjeći intenzitet bez pribavljanja daljnjeg kvaliteta optičkih rezanja (rezultirajući nepotrebnim slikama buke).
Slika 3: Otkrivanje u konfokalnom snimanju. Svetlost iz uzorka S fokusirana je na promatranje zapere (PO), a zatim na detektoru de.
Optički put konfokalnog skeniranja
Put sabojnog snopa u konfokalnom sustavu skeniranja samo je kombinacija osvjetljenja i otkrivanja točke točke. Ova kombinacija se može koristiti kao optički nož. Samo fotoni iz žarišne ravnine mogu se prenijeti na senzor. Dok su svi fotoni s drugih mjesta filtrirani. Optičko rezanje realizira se pomoću "prostornog filtra".
Budući da se samo jedno mjesto pojavljuje "CONFOCAL" snimanje u određenom vremenu, potreban je uređaj za skeniranje za premještanje mjesta na objektno polje u režimu mreže. Obično se optičko ogledalo instalirano na motoru skeniranja i koristi se za izvršavanje postupka skeniranja. Postoji usko grlo u vrijeme potrebno za skeniranje punog okvira (obično) 1,024 linije. Poboljšanja su postignuta uvođenjem skenera velike brzine (rezonantni skener) koji skenira 8, 000 ili više linija u sekundi.
Samo pod mikroskopskom tehnologijom reflektirane svjetlosti može se postići dobar optički kriški. To je jedan od razloga energičnog razvoja fluorescentne mikroskopije posljednjih 20 godina (drugi razlozi uključuju izum imunostantske, DNK hibridizacije, fluorescentne biosenzore, kvantne tačke i fluorescentne proteine).
Slika 4: S lijeva na desno: 1. Konus osvjetljenja ne samo da eksplodira fluorescentna boja u žarišnu ravninu, ali i pobudi ga gore i dolje. Ovdje predstavljeni zelenim dvostrukim konusom. 2. Emisijski pilinčić efektivno presreće svjetlost emitiranim iz žarišne ravnine. 3. Pored toga, svjetlost ispod žarišta neće proći kroz pilingu. 4. U konfokalnom sustavu, samo će svjetlost iz uzorka dostići detektor. Otkrivanje prstenika učinkovito će odbiti bilo kakvo svjetlo iz drugih područja. Konačno, dobije se pravi optički odjel.
